Реклама на портале

Техника проведения аллергологических проб. Основные методы диагностики аллергии Исследование специфических антител IgE

  • анамнез, осмотр, аускультация, осмотр ЛОР-органов;
  • кожные пробы (прик - тест, скарификации) с широким спектром аллергенов;
  • провокационные пробы (назальный, конъюнктивальный и ингаля-ционный);
  • иммунологическое обследование скрининговое;
  • исследование интерферонового статуса;
  • скрининговое аллергологическое обследование (определение методом ИФА уровня специфических IgE, IgG антител к бытовым, эпидер-мальным, пищевым, пыльцевым аллергенам);
  • исследование функции внешнего дыхания (ФВД);
  • общие анализы крови, мокроты, цитология назального секрета - по показаниям.

Первичная консультация врача аллерголога - иммунолога начинается с опроса пациента. При диагностике аллергии необходимо выяснить у пациента, когда впервые появились симптомы заболевания, условия их возникновения и развития, в каких случаях аллергическая реакция выражается максимально, условия быта и работы, наличие животных, имеются ли аллергические заболевания у родственников и т.д.

Следующий этап - диагностики аллергических заболеваний постановка кожных проб (прик - тест, скарификации) с пыльцевыми, бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами.

При проведении кожных тестов на кожу наносятся или внутрикожно вводятся определенные аллергены. По реакции на них (покраснение, появление аллергической реакции в месте нанесения/введения аллергена) судят о наличии аллергии.

Для выявления скрытого бронхоспазма проводится исследование функции внешнего дыхания (ФВД).

Пациентам с частыми простудами, обострениями хронических заболеваний, герпесом, аллергическими заболеваниями, с хронической ЛОР-патологией, длительным субфебрилитетом, иммунодефицитными состояниями и пр. проводится исследование иммунного (определение состояния иммунной системы) и интерферонового статуса.

Что такое иммунограмма

Иммунограмма - это исследование основных показателей иммунной системы человека. Обычно определяются основные параметры иммунной защиты человека: количество и функциональная способность (например фагоцитарные индексы) лейкоцитов, их процентное соотношение; клеточный иммунитет - общее количество Т-лимфоцитов и их популяции; гуморальный иммунитет - уровень иммуноглобулинов (антител) классов А, М, G, Е и количество В - лимофоцитов; определение показателей системы комплимента и интерферона.

После обнаружения аллергена, установления причины заболевания назначается лечение. В настоящее время разработано огромное количество способов иммуно-аллергологического обследования пациентов, включающих самые современные методы диагностики аллергии. Врач аллерголог-иммунолог в каждом конкретном случае составляет индивидуальный план обследования. Ведьправильный диагноз и составление плана лечения возможно только после комплексного обследования.

Аллергологический метод исследования (АЛМИ) используется для выявления в организме Ат или сенсибилизированных Т-лимфоцитов к аллергену.

Задачи АЛМИ:

    диагностика хронических инфекционных заболеваний, в патогенезе которых имеет место сенсибилизация к микробным антигенам (ГЗТ);

    диагностика аллергических заболеваний (ГНТ);

    разработка специфической десенсибилизирующей терапии реакций ГНТ медиаторного типа.

Этапы АЛМИ:

I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:

    установления наследственной предрасположенности к аллергии;

    выявления факторов, отягощающих личный аллергологический анамнез:

– перенесенных острых заразных и инфекционных заболеваний;

– наличия в данное время или в анамнезе хронических воспалительных заболеваний (хронический тонзиллит, синусит, ринит, холецистит, колит, хронические язвы кожи, микробная экзема, фурункулёз, кожные грибковые заболевания);

– выявление пищевой аллергии, ингаляционной аллергии, инсектной аллергии, контактных дерматитов;

– получение сведений о профилактических прививках и реакциях на них;

– получение сведений о введении гетерологичных сывороток и реакциях на них;

– получение сведений о реакциях на введение антибиотиков, частоте применения антибиотиков, сведения о непереносимости других лекарств.

  2. установление эффекта элиминации аллергена: связи между контактом с аллергеном и изменением состояния пациента.

Так, аллергию к клещам домашней пыли можно заподозрить при развитии обострений, связанных с уборкой помещения, работе с книгами. При смене места проживания выраженность симптомов часто уменьшается, иногда вплоть до полной клинической ремиссии, в виду отсутствия контакта с аллергенным триггером.

При аллергии на производственные аллергены наблюдается ухудшение состояния после выходных («эффект понедельника»).

При лекарственной аллергии отмечается смягчение или исчезновение симптомов аллергии после отмены препарата.

    предположения по группе аллергена:

– связь с простудными заболеваниями у больных с инфекционно-аллергической бронхиальной астмой, аллергическим ринитом;

– наличие сезонности;

Так, при поллинозах связь обострения заболевания с периодом цветения растений обычно настолько очевидна, что проведение аллергологического обследования становится необходимым лишь с целью уточнения спектра аллергенов для проведения специфической десенсибилизации.

Атопический дерматит, обусловленный гиперчувствительностью к аллергенам домашней пыли и плесневых грибов, обостряется ранней весной еще до цветения растений и поздней осенью (больше времени проводится в помещении).

– наличие наследственной предрасположенности при медиаторном типе ГНТ;

5) дифференциации пищевой аллергии с парааллергией (употреблением большого количества продуктов, содержащих биологически активные амины, что имитирует патофизиологическую стадию медиаторного типа ГНТ) и идиосинкразией (непереносимостью отдельных продуктов, например, молочных, обусловленной ферментопатией).

В диагностике пищевой аллергии существенное значение имеют сведения, четко указывающие на связь обострения с приемом конкретного пищевого продукта. При этом учитывается только обострение, которое развивается во временном диапазоне от нескольких минут до 4 часов с момета употребления в пищу подозреваемого продукта.

Существенное значение для выявления пищевых аллергенов имеет установление непереносимости продуктов, сходных по антигенной структуре с подозреваемым аллергеном. Например, пациенты, имеющие аллергию на куриное яйцо, чаще всего не переносят и мясо курицы. При непереносимости коровьего молока нередко отмечается аллергия на говядину.

II этап АЛМИ. Постановка кожно-аллергических проб предполагает введение предполагаемого аллергена в организм больного.

А. Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований.

Кожно-аллергические реакции при инфекционных заболеваниях появляются относительно рано (с 4–5 дня болезни), достигают наибольшей интенсивности на 2–3 неделе болезни. В зависимости от выраженности или напряженности аллергического процесса положительная реакция может сохраняться годами (напр., при бруцеллёзе) или исчезать довольно быстро, в течение нескольких недель-месяцев (напр., при дизентерии). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю (рис. 50, 51).

Кожно-аллергические пробы для диагностики ГЗТ предполагают внутрикожное введение Аг (аллергена). Аллергенные препараты готовятся специальными учреждениями – институтами вакцин и сывороток. Предполагаемый аллерген вводят внутрикожно в объёме 0,1 мл. Результат учитывают через 24–72 часа после введения аллергена по диаметру папулы (инфильтрата).

Рис. 50. Постановка пробы Манту

Рис. 51. Учет пробы Манту

Б. Кожные тесты используются при диагностике ГНТ медиаторного типа. Введенные в практику в 1911 году, кожные тесты остаются одним из самых достоверных диагностических тестов in vivo. Именно кожные тесты являлись и являются ориентиром для определения достоверности всех тестов in vitro. Кожное тестирование – ценный метод диагностики сенсибилизации, который широко используется во всех странах мира.

Для кожных тестов используют растворы аллергенов: трав, пыльцы, эпидермиса животных, яда насекомых, пищи, лекарств. Степень диагностической чувствительности кожных проб увеличивается в следующем порядке: капельная, аппликационная (накожная), укол (прик-тест), скарификационная (через царапину), внутрикожная.

Капельные пробы – аллерген наносится на неповреждённую кожу в виде капли.

Аппликационные пробы – раствором аллергена смачивают марлевый тампон и накладывают его на неповрежденный участок кожи (внутренней поверхности предплечья или спины). Затем этот участок заклеивается перфорированным лейкопластырем (рис. 52).

Рис. 52. Аппликационные пробы на коже спины

Оценка результатов проводится как в течение первого часа после нанесения на кожу аллергена (ГНТ), так и спустя 24–48 часов (ГЗТ). Оцениваются гиперемия кожи, зуд, отечность, мокнутие в месте нанесения вещества. Аппликационные тесты незаменимы для оценки индивидуальной переносимости различных наружных средств для лечения и ухода за кожей.

Скарификационные пробы – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовым скарификатором делают небольшие царапины (рис. 53).

Рис. 53. Постановка скарификационных проб

Прик-тесты – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовыми иглами делают легкие уколы (на один миллиметр в глубину).

Внутрикожные тесты – разведенный 1:100 (по отношению к кожным тестам) аллерген вводят внутрикожно в кожу предплечья в объёме 0,1 мл. Внутрикожные тесты ставятся с ингаляционными аллергенами в сложных диагностических ситуациях, когда клинические данные убедительно свидетельствуют о наличии сенсибилизации, а результаты кожных тестов сомнительны. Внутрикожные тесты с пищевыми аллергенами проводить категорически запрещено из-за их чрезмерной чувствительности и возможности провокации анафилактической реакции.

Противопоказания к кожному тестированию:

– обострение текущего аллергического заболевания;

– острое инфекционное заболевание (ОРВИ, ангина и др.);

– хроническое заболевание в стадии декомпенсации;

– беременность;

– туберкулезный процесс любой локализации в период обострения;

– психическое заболевание в период обострения;

– коллагенозы;

– злокачественные заболевания;

– длительная терапия кортикостероидами или местное их применение в области кожи, где предполагается проведение проб (отказаться за 2 недели до проведения проб);

– прием антигистаминных препаратов (отказаться за сутки до проведения проб);

– возраст старше 60 лет.

В таких ситуациях кожное тестирование запрещается или откладывается.

Кожное тестирование проводить нецелесообразно при:

– указании в анамнезе на острую реакцию к определенному аллергену (для исключения возможных анафилактических реакций);

– отсутствии подозрений на аллергическую природу заболевания;

– отказе родителей больного ребенка или самого больного от проведения тестирования;

– наличии у больного выраженного дермографизма;

– наличии у пациента инфекционных заболеваниях кожи или поражения кожи (отсутствии непораженных участков для проведения тестирования).

В этаких ситуациях кожное тестирование откладывают или используют лабораторные методы диагностики.

Аллергологические пробы проводятся в процедурном кабинете аллергологического отделения под контролем врача-аллерголога.

За один раз проводится не более 15 проб с различными аллергенами и 2 контроля. Положительный контроль содержит гистамин и указывает на то, что соблюдены все условия постановки теста. Отрицательный контроль содержит жидкость, которая не должна вызывать каких-либо кожных реакций (напр., изотонический раствор хлорида натрия). Результаты постановки кожных проб оцениваются относительно контролей. Если пациент перед проведением кожной пробы принимал антигистаминные препараты, то положительный контроль и пробы на аллергены не дадут реакции.

Положительный результат ГНТ регистрируется, если через 20 минут после контакта с аллергеном:

– наблюдаются везикула (волдырь) или эритема;

– наблюдается только эритема диаметром больше 20 мм;

– имеются признаки общей реакции (головокружение, тошнота).

При этом степень кожной реакции на аллерген оценивают по шкале от одного (+) до четырех (++++) плюсов:

+ – везикула или эритема до 3 мм;

++ – везикула или эритема до 6 мм;

+++ – везикула или эритема до 10 мм;

++++ – везикула или эритема более 10 мм.

Положительный контроль должен показать реакцию на ++ или +++, а отрицательный контроль – ничего не показать.

Рис. 54. Результаты кожных проб

Положительные результаты кожного тестирования свидетельствуют только о наличии сенсибилизации к аллергену и не являются доказательством его причинной значимости в возникновении заболевания. Аллерген, кожная проба на который положительна, можно считать причиной заболевания, только в том случае, если это совпадает с клиническими проявлениями и данными анамнеза. В то же время своевременное выявление сенсибилизации к аллергенам играет решающую роль при назначении профилактических мероприятий.

Если подозревалась аллергия на конкретный аллерген, а результат кожной пробы отрицателен, это не исключает аллергию на этот аллерген. Проба может быть повторена с другими сериями того же аллергена, так как разные серии аллергенов в зависимости от стандартизации аллергенов и индивидуальной чувствительности могут действовать по-разному. Кроме того, следует учитывать, что чувствительность кожи и слизистых оболочек (конъюнктивы глаз, слизистой носа) отличаются от друга. Поэтому при несовпадении результатов или сомнении ставят элиминационно-провокационные пробы.

Необходимость в проведении элиминационно-провокационных тестов чаще всего возникает у больных с атопическим дерматитом, так как у них наблюдаются положительные кожные пробы к множеству пищевых аллергенов, в то время как клинически значимыми обычно оказываются 1–3 пищевых продукта. Если в таких ситуациях, основываясь только на результатах кожных тестов, без проведения элиминационно-провокационного тестирования, исключить из питания множество продуктов, это будет неоправданным.

III э тап АЛМИ. Постановка провокационных проб предполагает воспроизведение симптомов аллергической реакции через принудительный контакт с аллергеном в период ремиссии.

Провокационные пробы применяют по строгим показаниям, когда имеются расхождения между данными анамнеза, результатами кожных проб и данными лабораторного обследования. При наличии аллергии на конкретный препарат, ставить провокационные тесты не рекомендуется. Провокационные пробы проводят в специализированных центрах, так как шоковая реакция возможна даже на микрограммы препарата.

Для провокационных проб могут быть использованы пероральный (пищевой), конъюнктивальный, назальный, ингаляционный или холодовой тесты. Если в ответ на введение предполагаемого аллергена развивается аллергическая реакция, то аллерген может считаться причинно значимым.

IV этап АЛМИ. Постановка элиминационных тестов. Элиминационные тесты используют для подтверждения причинного аллергена, если с ним имеет место постоянный контакт (напр., при пищевой аллергии). Элиминационная диета, исключающая определённые продукты, обладающие сесибилизирующим действием на организм пациента, назначается на 1-2 недели. При улучшении состояния пациента проводится провокационная проба, подтверждающая причинный аллерген.

V этап АЛМИ. Лабораторные методы выявления эффекторных молекул Ат и биологически активных аминов, а также сенсибилизированных лимфоцитов к аллергенам, опосредующих клинические проявления аллергических реакций. Лабораторные методы диагностики аллергии используются при наличии противопоказаний к кожным тестам. Лабораторные методы диагностики аллергии подробно изучаются в курсе иммунологии.

После аллергологического обследования пациента врач заполняет паспорт больного аллергией – медицинский документ, содержащий все сведения об аллергическом заболевании, которым страдает данный человек. Паспорт (или его копию) страдающий аллергией должен всегда иметь с собой и предъявлять при обращении за медицинской помощью.

Оценка АЛМИ.

    Достоинства АЛМИ:

    ранний метод диагностики ГНТ. При постановке кожно-аллергических проб можно выявить сенсибилизацию к определённому аллергену (напр., домашней пыли, стрептококкам) даже без признаков реализации в аллергическую реакцию. Кожно-аллергические пробы используются также для определения состояния сенсибилизации к антибиотикам и гетерологичным сывороткам.

    быстрота получения результатов при постановке кожно-аллергических проб для диагностики ГНТ.

    лабораторные методы диагностики ГНТ in vitro предпочтительны по безопасности и возможности использования в любой период заболевания. Они имеют основное значение в случаях, когда нельзя применять кожно-аллергические пробы и провокационные тесты.

    выявление причинного аллергена позволяет проводить патогенетически обоснованную десенсибилизирующую терапию; этот подход наиболее успешно в настоящее время используется при поллинозах (пыльцевой аллергии).

15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;

Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа - возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа - возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа - возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа - условно-патогенные микробы - возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе - особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань - материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии - вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии - микологического, в протозоологии - протозоологического, в вирусологии - вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже - в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция - ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды - среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже - люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность - несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика - раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.

Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества - система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

1. Аллергический.

2. Микроскопический.

3. Культуральный.

4. Биологический.

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.

Аллергические заболевания – группа заболеваний, характеризующихся комплексом патофизиологических процессов, ключевым звеном которых является избыточная сенсибилизация иммунной системы к определенным этиологическим факторам (аллергенам). У больного с аллергическим заболеванием при первичном контакте с аллергеном происходит образование специфических антител или специфически реагирующих Т-лимфоцитов. При повторном контакте развивается реакция гиперчувствительности, тип которой определяется видом аллергена, локализацией проникновения аллергена в организме, а также рядом внутренних и внешних факторов.

Лабораторная диагностика аллергических заболеваний становится все более важной составляющей комплексного обследования, проводимого врачом-аллергологом. Важным преимуществом такой диагностики аллергических заболеваний является о, что она, в отличие от кожных аллергопроб, практически не имеет противопоказаний к проведению исследования. Взятие крови для анализа безопасно и может быть проведено у людей любого возраста и состояния, в т. ч. у грудных детей и беременных женщин. Лабораторные исследования можно выполнять и в период повышенной сенсибилизации или обострения заболевания, проводить на фоне лечения. В ряде случаев (элиминация конкретного аллергена, анти-IgE терапия) мониторинг лечения проводят при помощи соответствующих лабораторных исследований.

Увеличению роли лабораторной диагностики в аллергологии способствуют объективные причины, связанные со значительным ростом числа аллергических заболеваний и их распространенности. Существенно увеличилось и число аллергенов, которые способны привести к тяжелым клиническим последствиям, в т. ч. новых аллергенов искусственного происхождения. В таких условиях возникает потребность скринингового обследования большого числа людей с подозрением на аллергические заболевания.

Аллергены, вызывающие патологическую иммунную реакцию у пациента, называют причинно-значимыми или причинными аллергенами. Моноаллергенами называют выделенные из причинно-значимого аллергена отдельные вещества (белки, полисахариды, гликопротеиды, металлопротеиды), к эпитопам которых вырабатываются специфические антитела или рецепторы лимфоцитов. Моноаллергены играют большую роль в современной аллергологии, так как в одном причинно-значимом аллергене может содержаться целый комплекс потенциальных моноаллергенных компонентов, но только один или несколько из них будут реальными этиологическими агентами аллергических реакций у конкретного пациента. Для определения специфических антител в наборах реагентов нового поколения используются препараты подобных аллергенов, полученные по технологиям высокой очистки экстракта природного источника или созданные путем биотехнологических процессов. Разработанные новые технологии позволяют провести анализ для выявления сразу большого числа аллергенов одновременно, выполнить скрининговое обследование без подробного выяснения анамнеза. В арсенале многих производителей наборов реагентов для аллергодиагностики тысячи аллергенов, к которым можно определять специфические антитела.

В лабораторной диагностике аллергических заболеваний определяют преимущественно уровень общих IgE-антител и специфических IgE- и IgG4-антител в сыворотке крови к отдельным аллергенам или группам аллергенов природного или искусственного происхождения. IgE-зависимая реакция возникает в течение нескольких минут после контакта с аллергеном, а IgG (IgG4)-зависимая (наиболее часто встречаемая при пищевой аллергии) развивается в более поздние сроки – через часы, иногда даже через несколько суток после контакта с аллергеном.

Показания к исследованию

  • Скрининг аллергических заболеваний;
  • развернутое обследование в срочных клинических случаях;
  • выбор адекватной терапии и контроль тактики ведения пациента;

Методы исследования: Для определения антител (общий IgE, специфические IgE, IgG, IgG4) используют различные иммунохимические методы исследования.

Общий IgE

В норме концентрация суммарных (общих) IgE-антител очень мала и не превышает 0,05% по сравнению с концентрацией IgG-антител. Общее количество IgE-антител начинает возрастать у ребенка после рождения и продолжает расти до 10–14 лет, после чего у здоровых людей стабилизируется на постоянном уровне и снижается после 60 лет. Повышение уровня концентрации общего IgE в крови наблюдается преимущественно при аллергических заболеваниях, развивающихся по механизму реакций гиперчувствительности I типа (атопические заболевания). В большинстве случаев повышение концентрации общих IgE выше 100 U/л у взрослых людей и более 20 U/л у детей до 4 лет может свидетельствовать об аллергическом заболевании.

Определение специфических IgE выполняют при наличии IgE-зависимой пищевой аллергии, а также при невозможности проведения кожных проб, в т. ч. у детей и лиц пожилого возраста, у пациентов с заболеваниями кожи, аллергическими реакциями в анамнезе и др. Интерпретация результатов исследования требует осторожности, заключение должно быть сделано врачом-аллергологом с учетом анамнеза и клинической картины заболевания.

Специфические IgG

В последние годы внимание аллергологов привлекает IgE-независимая пищевая аллергия, иммунопатогенез которой связан с выработкой различных подклассов IgG антител, участвующих в иммунопатологических реакциях с хроническими воспалительными заболеваниями и “скрытыми” формами пищевой аллергии. Для диагностики скрытой пищевой аллергии используют количественное определение подклассов IgG специфических антител (IgG1-IgG4) к индивидуальным антигенам пищевых продуктов. Как и при интерпретации результатов выявления общего и специфических IgE, заключение должно быть сделано врачом-аллергологом с учетом анамнеза и клинической картины заболевания.