Векторы на основе вирусов животных. Типы вирусных векторов, используемых в генотерапии
1. Биотехнология. Наука биотехнология. Этапы развития биотехнологии.
2. Области применения биотехнологии. Области использования биотехнологии. Оптимизация микробиологических процессов в биотехнологии.
3. Промышленное применение микроорганизмов. Производство продуктов микробного синтеза. Производство антибиотиков. Производство вакцин.
4. Генная инженерия. Биобезопасность. Актуальность генной инженерии. Теоретическая база генной инженерии.
5. Организация генетического материала в клетке. Генотип. Что такое генная инженерия? Этапы получения генной продукции.
6. Применение методов генной инженерии. Показания (оправданность) применения генной инженерии. Причины применения генной инженерии.
7. Биобезопасность в генной инженерии. Документы регламентирующие биобезопасность.
8. Группы опасности микроорганизмов. Оценка риска применения генетически модифицированных микроорганизмов.
9. Генная диагностика. Генная терапия. Что такое генная диагностика и генная терапия? Виды генной терапии.
10. Векторы. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Векторы на основе ДНК-геномных вирусов. Невирусные векторы.
11. Перспективы генной терапии. Будущее генной терапии. Задачи генной терапии.
Векторы. Векторы на основе РНК-содержащих вирусов. Векторы на основе ДНК-геномных вирусов. Невирусные векторы.
Как было указано выше, для переноса соответствующих генов в клетку используют различные векторы [от лат. vector, переносчик]. Основная проблема при их разработке - преодоление иммунологического барьера реципиента, ограждающего организм от различных внешних воздействий, в том числе и от внедрения чужеродной ДНК в геном клеток. В этом плане особый интерес представляют вирусы, так как из всех известных агентов лишь они способны более или менее успешно интегрировать генетический материал в геном клеток человека. Поэтому все усилия специалистов генной терапии на настоящий момент сконцентрированы в области генной инженерии вирусов, применяемых в качестве векторов, доставляющих терапевтические гены в клетки организма больного.
Векторы на основе РНК-содержащих вирусов
РНК-геномные вирусы легко интегрируют в геном клетки-хозяина, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию необходимого гена. Для создания генно-терапевтических векторов наиболее перспективны ретровирусы. С их участием проведено около 60% всех клинических попыток генной терапии.
Ретровирусы относительно безвредны для человека, исключая, конечно, ВИЧ и Т-лимфотропные вирусы человека. Наиболее часто в качестве вектора применяют вирус лейкемии мышей. При разработке векторов из их состава полностью исключают гены, кодирующие синтез продуктов, обеспечивающих репродукцию. Кодирующая ёмкость трансгенов в составе ретрови-русных векторов не превышает 8000 пар оснований нуклеиновых кислот.
Основные проблемы применения РНК-вирусных векторов - эффективная доставка генетического материала в клетки, поддержка долговременной экспрессии и трансдукция неделящих-ся клеток (большинство РНК-векторов неспособно к эффективному переносу трансгенов в покоящиеся клетки). Однако неспособность ретровирусов к трансдукции покоящихся клеток в конкретной ситуации может оказаться и выгодной, например, в генной терапии глиобластом (злокачественные опухоли мозга). Идея их применения заключается в избирательной трансдукции делящихся клеток в очаге поражения - опухолевых клеток и клеток сосудов; нервные клетки не делятся и потому не служат мишенью ретровирусных векторов.
Векторы на основе ДНК-геномных вирусов
Векторы , созданные на основе ДНК-вирусов обладают большими размерами по сравнению с РНК-геномными вирусами и поэтому могут вмещать фрагменты ДНК (трансгены) длиной до 35 000 пар оснований.
Аденовирусные векторы . На основе аденовирусов создают векторы для генной терапии in situ муковисцидоза и злокачественных опухолей. Аденовирусные векторы способны к высокоэффективной трансдукции большого спектра клеточных типов человека, включая неделящиеся клетки. Особое внимание заслуживают векторы на основе аденоасеоциированного вируса. Аденоассоциированный вирус - непатогенный вирус, широко распространённый у человека (AT к его Аг обнаруживают у 80% людей). Вирус тропен к определённой части генома- он интегрируется преимущественно с коротким плечом хромосомы 19. В экспериментах показана эффективность векторов, созданных на основе аденоассоциированного вируса, в трансдукции клеток мозга, скелетных мышц и печени.
Другие ДНК-геномные вирусы . Среди остальных ДНК-содержащих вирусов относительно часто применяют вирус простого герпеса (ВПГ), проявляющий тропность к нервной ткани (соответственно используют для трансдукции клеток мозга).
Невирусные векторы
Невирусные векторы (молекулы ДНК со свойствами транспозонов или вставочных последовательностей) менее распространены, чем векторы на основе вирусов. Тем не менее не вирусные векторы обладают многими преимуществами, такими как безопасность и простота конструирования. Путём конструирования синтетической системы по доставке генов внутрь клетки можно избежать опасности продуцирования рекомбинантного вируса или других токсических эффектов.
Векторы на основе бактериофага λ
Векторы на основе фага λпоявились в 1974 г.. ДНК фагаλдвухцепочечная, линейная, размер 48 502 пн. На концах имеются одноцепочечные ГЦ- концы длиной 12 н
Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечнуюлинейную молеклул ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла(репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующиелизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения исоставляет примерно 25 тысяч пар нуклеотидов. Данная часть может быть заменена на чужеродныйфрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл, но лизогения не происходит.Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК
Фаг M13 - нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК.
7. Векторы на основе вирусов животных
Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих используются для изучения функций и регуляции генов млекопитающих. Кроме того, с их помощью могут быть получены аутентичные рекомбинантные белки, которые потенциально могут использоваться в медицинских целях для лечения некоторых заболеваний человека. Уже сконструированные экспрессирующие векторы млекопитающих весьма многочисленны, но все они обладают сходными свойствами и похожи на другие эукариотические экспрессирующие векторы. Промоторы клонированного и селективного маркерного генов, а также их сигналы терминации транскрипции (сигналы полиаденилирования; должны происходить из клеток эукариот; обычно используют регуляторные последовательности ДНК вирусов животных (например, цитомеголовируса человека, SV40 или HSV) или генов млекопитающих (например, гена (3-актина, металлотионеина, тимидинкиназы или бычьего гормона роста). При этом более предпочтительны сильные промоторы и эффективные сигналы полиаденилирования. Последовательности, необходимые для отбора и амплификации экспрессирующего вектора млекопитающих в Е. coli, происходят из стандартного клонирующего вектора Е. coli (например, плазмиды pBR322).
Селективные маркерные гены. Для отбора трансфицированных клеток млекопитающих часто используют бактериальный ген Neor, кодирующий неомицинфосфотрансферазу. В этой системе применяется токсичное соединение генетицин (G-418), блокирующее трансляцию в нетрансфицированных клетках млекопитающих. При этом в трансфицированных клетках G-418 фосфорилируется неомицинфосфотрансферазой и инактивируется. Следовательно, выживают и пролиферируют только клетки, синтезирующие продукт гена Neor.
Другая система отбора трансфицированных клеток млекопитающих основана на использовании гена, кодирующего фермент дигидрофолатредуктазу (DHFR). В этой системе используют клетки с дефектным геном DHFR, т. е. клетки, в которых функциональная DHFR не синтезирeется. После трансфекции DHFR-клеток экспрессирующим вектором млекопитающих с функционирующим DHFR-геном в среду добавляют метотрексат. Не трансфицированные клетки не растут в его присутствии, а клетки, синтезирующие дигидрофолатредуктазу, выживают. После предварительного отбора клеток с DHFR-геном концентрацию метотрексата в среде увеличивают и отбирают клетки с большим числом копий вектора, синтезирующие в большом количестве рекомбинантный белок.
В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньшей вероятностью. Высокий уровень экспрессии клонированного гена достигался при ее координации с экспрессией селективного маркерного гена. Для этого, например, ген DHFR встраивали поблизости от клонированного гена, так чтобы оба гена находились под контролем одного промотора и имели общий сигнал полиаденилирования, а ген DHFR был фланкирован сайтами сплайсинга интрона. DHFR и рекомбинантный белок транслировались с первичного транскрипта и сплайсированной мРНК соответственно.
Экспрессия двух клонированных генов в одной клетке млекопитающих
Некоторые ценные в коммерческом отношении белки в активной форме состоят из разных полипептидных цепей. Например, тиреотропный гормон человека - это гетеродимер, а гемоглобин - тетрамер, состоящий из двух субъединиц, по две копии каждая (а2(32). Чтобы получить активный мультимерный белок, можно попытаться клонировать ген или кДНК каждой из субъединиц, синтезировать и очистить субъединицы, а затем смешать их в пробирке. Однако таким образом удается получить лишь немногие мультимерные белки, поскольку in vitro правильная укладка полипептидных цепей осуществляется редко. Сборка же димерных и тетрамерных белков in vivo протекает весьма эффективно. Поэтому были разработаны стратегии синтеза двух разных рекомбинантных белков в одной клетке.
Для этого хозяйские клетки одновременно трансфицировали двумя экспрессирующими векторами млекопитающих, каждый из которых нес ген или кДНК одной из субъединиц и разные гены селективных маркеров. Трансфицированные клетки подвергали двойному отбору, соответственно и выжившие клетки несли оба вектора. Системы с двумя векторами успешно использовались для синтеза аутентичных димерных и тетрамерных рекомбинантных белков. К сожалению, дважды трансфицированные клетки часто утрачивают один из двух векторов. Кроме того, число копий каждого из векторов не всегда одинаково, так что одна субъединица может синтезироваться в большем количестве, чем другая, и выход конечного продукта может снижаться. Чтобы решить эти проблемы, были сконструированы векторы, содержащие оба клонированных гена. В некоторых случаях они были помещены под контроль независимых промоторов и сигналов полиаденилирования. А для того чтобы гарантировать синтез рекомбинантных белков в одинаковом количестве, были созданы так называемые двухцистронные векторы, в которых клонированные гены разделялись сегментом ДНК, содержащим внутренний сайт связывания рибосом. Такие сайты были обнаружены в геномах вирусов млекопитающих; они обеспечивают одновременную трансляцию различных белков с полицистронной мРНК. Транскрипция конструкции «ген-внутренний сайт связывания рибосом-ген» регулируется одним промотором и одним сигналом полиаденилирования. Синтезируется один транскрипт с двумя генами, трансляция начинается с 5"-конца мРНК и с внутреннего сайта.
Суммируя, можно сказать, что экспрессирующие векторы млекопитающих столь же универсальны и эффективны, как и векторы для других эукариотических систем экспрессии, если речь вдет о получении аутентичных рекомбинантных белков для исследовательских и медицинских целей. Однако промышленный синтез рекомбинантных белков с использованием модифицированных клеток млекопитающих обходится слишком дорого.
Лентивирусы относятся к ретровирусам и характеризуются более длительным инкубационным периодом. Терапевтическим преимуществом векторов на основе лентивирусов, по сравнению с ретровирусными векторами, является их способность переносить длинные фрагменты генетической информации в геном инфицируемой клетки. Эти вектора основаны преимущественно на вирусах иммунодефицита человека (ВИЧ) и быка, и обладают всеми уникальными характеристиками вирусного вектора MoMLV, а также способностью переносить гены в постмитотические клетки in vitro и in vivo (18). Несмотря на подтверждение эффективного переноса генов в раковые клетки на моделях солидных опухолей с помощью векторов на основе ВИЧ, терапевтическое использование этих векторов вызывает опасения, поскольку ВИЧ является серьезным патогеном человека. Однако в настоящее время проводятся клинические испытания лентивирусных векторов, направленные на оценку безопасности их применения в терапии СПИДа (19). Более безопасными считаются вектора на основе лентивирусов быка. Одним из примеров таких векторов служит безопасный для человека вирус болезни Йембрана JDV (Jembrana Disease Virus), поражающий определенные виды крупного рогатого скота в округе Йембрана на острове Бали в Индонезии (20, 21). Вирус JDV обладает теми же преимуществами в качестве вектора, что и ВИЧ: он способен интенсивно размножаться и интегрироваться в хромосомы не пролиферирующих клеток.
(Б) Аденовирусные векторы
Одной из наиболее хорошо изученных и широко используемых систем доставки терапевтических генов в раковые клетки человека являются вектора на основе аденовирусов (АВ, adenoviral vector - AV). Они особенно полезны в тех случаях, когда необходима лишь временная продукция терапевтического гена. Аденовирусы способны к воспроизводству в больших количествах и характеризуются эффективным переносом генов в различные типы раковых клеток (22). Два варианта векторов на основе аденовирусов были одобрены в Китае для клинического применения (23).
Кроме этого, несколько векторов на основе собачьих, свиных, овечьих, бычьих и птичьих аденовирусов было разработано для генотерапии раков человека. Один из таких векторов продемонстрировал терапевтическую эффективность на модели рака простаты у животных (24).
Основной проблемой, возникающей при разработке аденовирусных векторов для терапии рака, является недостаточная инфицирующая способность вирусов. В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на повышение прицельности и терапевтической эффективности рекомбинантных аденовирусных векторов (25).
(В) Векторы на основе адено-ассоциированных вирусов
Вектора на основе адено-ассоциированных вирусов (ААВ, аdeno-associated virus - AAV) не вызывают токсического эффекта и проявляют высокую инфицирующую способность, как показывают доклинические испытания нескольких таких вирусов (26). На моделях глиомы у грызунов было продемонстрировано, что ААВ, кодирующий рецептор фактора роста сосудого эндотелия VEGF (vascular endothelial growth factor), способен блокировать рост опухолей. Несмотря на высокую эффективность ААВ, технология их получения и очитки представляет собой достаточно сложный и дорогостоящий процесс (27).
(Г) Векторы на основе вирусов герпеса
Благодаря высокой эффективности и не сложной методике получения, векторы на основе вирусов герпеса пользуются особенной популярностью среди разработчиков векторных систем. В настоящее время со многими вариантами терапевтических векторов на основе вирусов герпеса проводятся клинические испытания. Как в случае векторов на основе других вирусов, терапевтический интерес представляют только репликационно-компетентные штаммы вирусов герпеса. Первый вектор такого рода был создан на основе мутантного вируса герпеса с дефектным геном r34.5 , отвечающим за нейротоксичность вируса. Инактивация гена r34.5 ограничила способность вируса к размножению в клетках центральной нервной системы и блокировала возможность его существования в латентной форме. Однако позже обнаружилось, что отсутствие активности гена r34.5 значительно снизило способность мутантного вируса к воспроизводству в раковых клетках (28).
Терапевтические возможности векторов на основе вирусов герпеса могут существенно ограничиваться наличием к нему иммунитета у пациентов. Иммунный ответ организма предотвращает перенос вирусами терапевтических генов к периферическим органам и вызывает гепатотоксичность. Однако некоторые мутантные штаммы вирусов герпеса продемонстрировали успешное лечение рака печени в модели на мышах, обусловленное, как предполагают ученые, непосредственным вирусным онколизисом и активностью специфических эффекторных клеток иммунной системы (29).
(Д) Вирусные векторы направленного действия
Основной проблемой, связанной с генотерапией вирусными векторами, остается низкая эффективность адресной доставки генов в раковые клетки. На пути к клетке-мишени вирус сталкивается с физическим препятствием – эндотелиальной стенкой сосудов. В качестве одного из способов решения этой проблемы был разработан аденовирусный вектор, нацеленный на рецепторный механизм трансцитоза (прохождения сквозь клетки эндотелиалия) с помощью специальных адаптерных молекул (32). Подвергшиеся трансцитозу вирусные частицы сохраняли способность заражать клетки, но эффективность транспорта вирусов сквозь клетки оставалась низкой. В настоящее время разрабатываются аденовирусные вектора, содержащие как сигнальные молекулы, направляющие вирусы на трансцитоз, так и молекулы, опосредующие связывание и заражение раковых клеток, находящихся «по ту сторону» стенки сосудов (33).
(Е) Мультифункциональные частицы на основе вирусных векторов
Концепция мультифункциональных частиц (МФЧ) на основе вирусных векторов возникла относительно недавно. Она направлена на то, чтобы терапевтические вирусные векторы осуществляли сразу несколько функций: адресную доставку генетического материала именно в раковые клетки, давали возможность их визуализации в организме и обладали бы прогрессирующим онколитическим действием. В качестве примера МФЧ на основе вирусного вектора можно привести ААВ с модифицированными белковыми «шипами», находящимися на оболочке вируса (с помощью шипов вирус взаимодействует с клеткой-мишенью). Изменения позволили одновременно «нацеливать» вирусы на раковые клетки и визуализировать передвижение, воспроизведение и распространение ААВ. Взаимодействие тимидин-киназы ТК ВПГ, находящейся на поверхности модифицированного ААВ, с известным субстратом для позитронной эмиссионной томографии (Positron Emission Tomography, PET) 18F-пенцикловиром (18F-penciclovir) позволяет проводить мониторинг вирусных частиц в клинической практике. Кроме этого, фермент ТК ВПГ открывает возможности для так называемой суицидной генотерапии, суть которой заключается в следующем: фермент ТК преобразует свои субстраты (такие лекарства, как ганцикловир) в метаболиты, узнаваемые ферментами зараженной клетки. Последовательное воздействие клеточных белков на эти метаболиты приводит к образованию токсичного конечного продукта, вызывающего гибель клетки (34). Интересно, что продукция ТК ВПГ инфицированной опухолевой клеткой индуцирует самоуничтожение смежных клеток, в чем проявляется одно из свойств МФЧ – прогрессирующее онколитическое действие.
Концепция МФЧ на основе вирусных векторов открывает широкие возможности применения нанотехнологий. Мониторинг вирусных частиц можно осуществлять с помощью наноразмерных меток, иммобилизованных на оболочках вирусов (35). Однако вопрос об адресной доставке вирусных МФЧ в клетки опухоли остается открытым.
Механизмы генотерапии с помощью вирусных векторов
(А) Коррекционное добавление гена
Все онкологические заболевания принято подразделять на p53-зависимые и p53-независимые, поскольку большинство случаев заболевания раком опосредовано мутациями в гене p53 . Белок р53 представляет собой известный опухолевый супрессор, основная функция которого заключается в поддержании стабильности генома. Он принимает участие в регуляции клеточного цикла, в исправлении возникающих дефектов ДНК и в апаптозе – запрограммированной клеточной гибели. Воздействие на клетку факторов, вызывающих изменения в структуре ДНК, таких как ультрафиолетовое излучение, ионизирующая радиация и различные химические вещества, приводит к активации белка p53, который индуцирует либо арест клеточного цикла, необходимый для исправления возникших дефектов ДНК (репарацию), либо запускает механизм апоптоза. По этой причине мутации в гене p53 могут приводить к неконтролируемой клеточной пролиферации и к мутагенезу, опосредуя возникновение и прогрессию злокачественного новообразования.
Доклинические испытания показали, что замена мутантного гена p53 в раковых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии, приводит к полному восстановлению функций белка p53 и запускает апоптоз злокачественных клеток(36,37).
Клинические испытания ретровирусных и аденовирусных векторов, несущих неповрежденные гены p53 , оказались эффективными в замене дефектных генов p53 у пациентов, страдающих немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ, non small cell lung cancer - NSCLC) и бронхоальвеолярной карциномой (38,39,40). К сожалению, в клинических испытаниях не удалось обнаружить значительного терапевтического эффекта даже при совместном применении аденовирусных векторов, рекомбинантных по гену p53 дикого типа, и химиотерапии (41).
(Б) Суицидная генотерапия
Суть суицидной генотерапии заключается в доставке в злокачественные клетки гена, кодирующего фермент, который конвертирует пролекарство в лекарство - «суицидный токсин», вызывающий гибель зараженных раковых клеток. Ярким примером суицидного фермента является тимидинкиназа (ТК) вируса простого герпеса (ВПГ) (herpes simplex virus - HSV). ТК ВПГ преобразует нетоксичные аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир или ацикловир, в токсичные вещества, приводящие к гибели клеток. Наподобие описанной выше методики аденовирусного переноса гена p53, доклинические испытания аденовирусного вектора AdHSV TK (adenoviral HSV TK), кодирующего ТК ВПГ, продемонстрировали гибель не только инфицированных, но и смежных с ними клеток при систематическом введении ганцикловира. Эффект объясняется как воздействием токсинов, высвобождаемых зараженными клетками, на соседние клетки, так и ответом иммунной системы на инфекцию (42).
Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.
Недостатки ретровирусных векторов , побуждают искать другие векторные системы. Наибольшие надежды возлагают на аденовирусы и герпесвирусы. Геномы у этих вирусов представлены двухцепочечными ДНК и достаточно велики: 36 кб у адено- и 150 кб у герпесвирусов. Обычно они не интегрируют в геном клетки хозяина (хотя для герпесвирусов и сообщалось об интеграции отдельных частей вирусной ДНК).
Многие обычные серотипы аденовирусов являются патогенами человека, инфицирующими верхние дыхательные пути. Интактные аденовирусы использовались для целей вакцинации и в результате накопилась большая информация касательно безопасности этой системы для человека. Аденовирусы могут получаться с очень высокими титрами, до 10 12 инфекционных частиц в миллилитре культуральной среды. Для целей генной терапии на сегодняшний день в качестве векторов использовали два аденовирусных серотипа, 2 и 5. Аденовирусы проникают в клетку, взаимодействуя с двумя рецепторами. Они хорошо приспособлены для целей терапии in vivo, поскольку дают высокие титры вирусных частиц. Аденовирусы способны реплицироваться и в делящихся и в неделящихся клетках. Они не интегрируют в геном клеток-хозяев и остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность инсерционного мутагенеза, о которой мы говорили в случае ретровирусов. Инфекция пермиссивных клеток аденовирусом приводит к их лизису. Схематически аденовирусный геном представлен на Рис. 3 . Аденовирусный геном может быть превращен в дефектный по репликации путем делеции Е1 области . (Здесь следует оговориться, что требование Е1 гена для репликации не является абсолютным. При высокой множественности инфекции некоторая репликация все же наблюдается и у дефектных по Е1 области аденовирусов. Однако эта способность очень сильно подавлена). Вместо Е1 области может быть вставлен трансген примерно того же размера, что и в случае ретровирусных векторов, т.е. до 10 кб. Для того чтобы обеспечить рост таких репликационно дефектных рекомбинантных вирусов, созданы специальные рекомбинантные клетки, содержащие экспрессирующиеся гены Е1. Это очень похоже на ту хитрость, которую использовали в случае ретровирусов. Эти клетки комплементируют дефект аденовирусного вектора и позволяют ему размножаться и образовывать вирусные частицы, которые не могут реплицироваться в некомплементирующих клетках. На рис. 3 показаны места, в которые может быть встроен трансген. Это области Е1а,Е1b, и Е3. Аденовирусные векторы были использованы недавно для эффективной доставки генов в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей in vivo. Этот эпителий является природным местом инфекции для большинства аденовирусов, поэтому в данном случае аденовирусы имеют преимущество перед ретровирусами, поскольку последние, хотя и могут реплицироваться в эпителии, не могут быть получены в достаточно высокой концентрации для целей терапии in vivo. Однако, эпихромосомная локализация имеет и недостатки - продолжительность экспрессии трансгена невелика - недели, в лучшем случае месяцы. А хотелось бы побольше, хотелось бы на всю жизнь, ведь мы чаще всего имеем дело с наследственными, т.е. пожизненными болезнями. В результате аденовирусные векторы придется вводить пациентам не один раз и навсегда, а регулярно. Выдержит ли организм такое насилие?
