Реклама на портале

Подложки используемые для инженерии живых тканей. Тканевый инженер. Смотреть что такое "тканевая инженерия" в других словарях

В будущем, как говорят фантасты, для излечения от недуга нужно будет всего лишь зайти в аптеку, похожую на склад с запчастями. И выбрать нужную полку. Вот здесь — запасные глаза, вот — печень, почки, а в этом ящике — руки и ноги разных размеров… Не отстают от писателей и голливудские фантазеры, они тоже подливают масла в огонь этой темы: эффектно отрастающие новые руки и ноги супергероев впечатляют. Но в жизни, разумеется, все гораздо прозаичнее, нежели на экране. Хотя некоторые предпосылки к тому, чтобы в скором времени человек «примерил» биоискусственные органы, уже есть.

Тканевая инженерия — активно развивающаяся отрасль медицины и биологии — буквально воплощает фантастику в жизнь. Специалисты, занятые в этой области, изучая строение живых тканей, пытаются вырастить их в лабораторных условиях, чтобы затем использовать искусственно созданную ткань для трансплантации. Такое «производство» откроет очень серьезные перспективы. Стоит только вдуматься в это: заболевший (раненый, покалеченный) человек сможет быстро восстанавливаться, он получит неисчерпаемый источник для замены поврежденных органов. Ведь современные темпы урбанизации и развитие технических средств, как ни странно, подвергают жителей Земли все большим опасностям и болезням, всевозможным травмам в различных катастрофах, так что задача тканевых инженеров действительно широка — вырастить кости, хрящи и органы для замены поврежденных.

Как и все разделы медицины, тканевая инженерия имеет собственную терминологию и свои методологические подходы. Любая «тканеинженерная» процедура начинается с получения исходного клеточного материала — первого шага. Как правило, для этого проводят биопсию, то есть забирают у пациента, нуждающегося в биоискусственной ткани, клетки нужного типа. Однако не все клетки могут достаточно интенсивно размножаться в искусственной среде. Поэтому другой подход состоит в том, чтобы отобрать недифференцированные клетки-предшественники, так называемые стволовые клетки , которые будут созревать и специализироваться уже в лабораторных условиях. Этим определяется взаимосвязь тканевой инженерии с исследованиями стволовых клеток. Однако не следует отождествлять эти два направления биомедицинских исследований — тканевые инженеры работали над своими проектами еще задолго до того, как термин «стволовые клетки» стал знаком широкой публике.

Второй шаг — культивирование полученных клеток в лабораторных условиях (in vitro) с целью увеличить во много раз их количество. При этом в случае использования недифференцированных (стволовых) клеток они помещаются в специальную среду, которая индуцирует их превращение в клетки строго заданного вида. Чтобы понять, насколько это сложно, достаточно сказать, что в организме насчитывается более 200 разновидностей клеток. Для достижения нужного результата культивирование проводится в специальных биореакторах. В них не только моделируется состав газовой смеси и набор веществ в питательной среде, но и поддерживаются необходимые для развития клеток и тканей физические параметры — освещенность, течение или пульсация жидкости, гравитация и т. п.

Но для выращивания живой ткани мало просто получить достаточное количество нужных клеток, необходимо, чтобы они были надлежащим образом организованы в пространстве. Поэтому следующим шагом становится формирование трехмерного каркаса — носителя для искомой ткани, на котором они бы могли нормально развиваться и выполнять свои функции после пересадки в организм.

Наконец, в итоге всех этих сложных манипуляций появляется готовый биоискусственный эквивалент ткани — графт, и тогда наступает последний этап — его имплантация в тело пациента (графтинг). Использование собственных клеток пациента для изготовления графта — основополагающий принцип тканевой инженерии. Забирая аутоклетки, врачи избегают иммунологических проблем — отторжения пересаженного материала, благодаря чему шансы на удачный исход операции резко возрастают.

У истоков тканевой инженерии
Если не считать сотворения Евы из ребра Адама, то выращивание клеток и тканей началось на закате XIX века. В 1885 году немецкий эмбриолог Вильгельм Ру в течение нескольких дней смог поддерживать жизнеспособность фрагмента куриного эмбриона в искусственных условиях. Однако настоящих успехов в культивировании тканей вне организма удалось достичь только после экспериментов Р. Гаррисона в 1907 году: он предложил использовать свернувшуюся кровь или лимфу в качестве среды для развития тканей в лабораторной посуде — in vitro.

В Россию этот метод пришел в 1913 году, когда сотрудник Императорской Военно-медицинской академии П.П. Авроров и его коллега А.Д. Тимофеевский смогли в течение некоторого времени выращивать клетки лейкозной крови. А годом позже этой проблемой заинтересовался великий российский гистолог Александр Александрович Максимов, профессор той же академии, который не только подтвердил данным методом унитарную теорию кроветворения, то есть доказал, что все клетки крови развиваются из общего предшественника — стволовой клетки, но и заложил основу для дальнейших разработок в области культивирования тканей вне организма. На базе его результатов были выполнены сотни работ по выращиванию клеток соединительной ткани и крови, созданию тканеинженерных эквивалентов костной ткани. Его приоритет в этих исследованиях признан всемирно.

Настоящая же эра тканевой инженерии, да и собственно выделение ее как самостоятельной отрасли медицины, началась с дерзких работ К. Ваканти по совмещению в лабораторных условиях живых клеток и искусственных носителей для них, которые он предпринял в 80-х годах прошедшего столетия. На сегодня, пожалуй, не осталось ни одного человеческого органа, развитие и регенерацию которого тканевые инженеры не пытались бы «приручить».

Основа ткани

Выбор носителя для развития искусственной ткани — одна из самых серьезных проблем тканевой инженерии. Его материал должен быть безопасным как для тех клеток, которые на нем будут жить, так и в целом для организма, куда потом будет пересаживаться биоискусственная ткань. В идеале материал со временем полностью замещается тканью организма. При этом он должен иметь уникальную, характерную для данного типа ткани трехмерную организацию, которая воспроизводила бы структуру межклеточного матрикса живой ткани. Например, для воссоздания полых трубчатых органов используют лишенные жизнеспособных клеток участки аналогичных органов (кишечника, трахеи, мочеточников и мочевого пузыря), полученных от крупных животных. Но в качестве таких носителей могут быть применены другие, самые разнообразные и подчас весьма неожиданные материалы.

Проще всего (если, конечно, тут вообще уместно говорить о простоте) оказалось создать биоискусственные кости. В качестве источников клеток для будущих костей используют стволовые стромальные клетки костного мозга, которые могут развиваться в клетки разных тканей, а также остеогенные (способные образовывать костную ткань) клетки иного происхождения. Настоящее поле для фантазии представляется при выборе носителя для них. В ход идут коллагены различных типов, стеклокристаллические материалы, даже кораллы. Неплохой основой служат безжизненные (трупные) кости человека и животных, а также сложные синтетические конструкции, растворяющиеся за определенный срок в организме. В последнем случае основной проблемой является синхронизация процесса остеогенеза, то есть образования костной ткани в области ее дефицита и растворения привнесенной искусственной конструкции. На сегодняшний день по всему миру выполнено уже несколько тысяч хирургических вмешательств с использованием тканеинженерных эквивалентов костной ткани.

Весьма востребована на рынке медицинских услуг клеточная и тканевая реконструкция суставного хряща. Хрящ — особая ткань, которая в естественных условиях не регенерирует. По некоторым экспертным оценкам, рынок этих продуктов только в США может составлять сотни миллионов долларов в год.

Не обошли вниманием тканевые инженеры и кожу — самый большой орган на теле человека. Общая площадь кожного покрова взрослого мужчины достигает 2,5 м 2 при весе 15—20 кг (с учетом подкожной клетчатки). Кожа устроена достаточно сложно и выполняет ряд жизненно важных функций, вот почему при ее обширных повреждениях, помимо местных расстройств, могут наблюдаться и общие патологические проявления, подчас ставящие жизнь больного под угрозу. При сильных ожогах и длительно не заживающих язвах кожа неспособна сама восстанавливать свою целостность. На помощь приходят специалисты, у которых уже есть не только лабораторные прототипы, но и коммерческие образцы биоискусственной кожи. На сегодняшний день тысячи человек в мире уже успели воспользоваться услугами фирм, предлагающих на рынке медицинских услуг подобные тканевые препараты.

Но самых фантастических результатов достигли тканевые инженеры в детской практике. Растущий организм предъявляет особые требования к созданию тканеинженерных конструкций — ведь они должны расти вместе с организмом ребенка. Так, недавно немецкими учеными был создан тканеинженерный сердечный клапан. В качестве основы для клеток сосудистой стенки (эндотелия) был взят сердечный клапан взрослой свиньи. А источником клеточного материала стали клетки пуповинной крови ребенка. Между прочим, до недавнего времени пуповинную кровь при родах выбрасывали вместе с плацентой, но теперь все больше данных свидетельствует о том, что сохранение этих клеток в гемабанках в определенных случаях может дать шанс для спасения жизни человека.

Искусственная челюсть
Не так давно группа немецких специалистов из города Киль под руководством Патрика Варнке (Patrick Warnke) сообщила об успешном воссоздании нижней челюсти, которая была практически полностью удалена в связи с опухолевым поражением. Первоначально врачам пришлось создать титановый каркас челюсти, который был заполнен костным матриксом, костным мозгом пациента и факторами роста кости. Однако такой большой фрагмент не мог быть помещен сразу в область повреждения, ведь лишенные собственной сосудистой сети клетки костного мозга, в том числе и стволовые, не только бы не дифференцировались в остеобласты (клетки, продуцирующие костную ткань), но и погибли от кислородного голодания и отсутствия питательных веществ. Поэтому полученную конструкцию внедрили в мышцы спины. Это было сделано для того, чтобы в толще интенсивно снабжаемых кровью мышц сосуды сами проросли в толщу «биологического протеза». Когда это произошло, конструкцию извлекли и пересадили на должное место, предварительно соединив сосуды нижней челюсти и биопротеза микрохирургическим путем.

С каждым годом таких или подобных операций проводится все больше. Они позволяют не только восстановить функцию утраченного органа, но и обеспечить эстетический косметический эффект.

Сосуды — тканям!

Одним из факторов, ограничивающих фантазию тканевых инженеров, является невозможность создания относительно больших конструкций в связи с отсутствием их адекватного кровоснабжения и иннервации (связи с центральной нервной системой). Тканеинженерные конструкции, изъятые из искусственной среды, рискуют погибнуть из-за того, что в них нет кровеносных сосудов и в теле пациента они не будут в достаточной мере снабжаться питательными веществами. Частично эту проблему можно решить методом префабрификации — временного помещения созданной в лаборатории тканеинженерной конструкции под кожу или между мышц. Через некоторое время, когда сосуды прорастут весь объем графта, его выделяют с сохранением сосудов и переносят в область повреждения. Однако такой подход связан с нанесением пациенту дополнительной операционной травмы, поэтому тканевые инженеры нашли гениальное решение: биоискусственным тканям — биоискусственные сосуды! Первые работы были проведены с полимерными микротрубочками, выстланными изнутри эндотелием. Такие трубочки пронизывают всю толщу созданной в лаборатории ткани. Постепенно полимер рассасывается и не мешает обмену газами и питательными веществами между кровью и клетками.

На сегодняшний день уже практически ничто не ограничивает возможностей тканевых инженеров. Созданы не только лабораторные прототипы, но и применены в клинической практике тканеинженерные эквиваленты сосков молочных желез, биоискусственный мочевой пузырь, мочеточники. Определены методические подходы к созданию легких, печени, трахеи, участков кишечника и даже кавернозных тел полового члена.

Конструирование паренхиматозных органов — печени, легких и других — представляет особую сложность, поскольку все клетки в них находятся в тонкой взаимосвязи и должны строго занимать надлежащее им место в трехмерном пространстве. Неожиданные положительные результаты здесь проявились при выращивании клеток во взвешенном состоянии — без прикрепления к поверхности. Группа исследователей под руководством профессора Колина Макгуккина (Colin McGuckin) из Университета Ньюкасла, Великобритания, использовала вращающийся биореактор, разработанный 10 лет назад специально для Международной космической станции. Он позволяет имитировать на Земле условия невесомости и микрогравитации. Оказалось, что при культивировании в нем стволовых клеток пуповинной крови можно добиться не только их превращения в функционально активные клетки печени, но и органогенеза — образования аналога печеночной ткани с присущими ей функциями.

Не менее удивительные результаты дали опыты по насыщению культуры клеток металлическими наночастицами посредством липосом, беспрепятственно проникающих через клеточную мембрану. Пребывание таких структур внутри клетки практически не оказывает на нее влияния. Зато ученые получают возможность контролировать рост клеток, воздействуя на них магнитными полями разной направленности. Таким способом удалось создать не только аналоги структур печени, но и такие сложные структуры, как элементы сетчатки глаза. Разработки тканеинженерного глаза еще находятся в самых начальных стадиях, но уже удалось получить эквиваленты отдельных его частей — роговицы, склеры, радужки. Правда, проблема интеграции полученных частей пока не решена. Тем не менее в научной литературе можно встретить сведения о трансплантации светочувствительных клеток — палочек и колбочек — в «святая святых» глаза — сетчатку, правда, пока только в экспериментальных условиях.

Пожалуй, чтобы окончательно почувствовать себя всемогущими, тканевым инженерам осталось лишь научиться воссоздавать в лабораторных условиях сложные производные нервных зачатков.

В ведущих западных и отечественных лабораториях специалисты пытаются воспроизвести развитие и другого крайне трудного для восстановления органа — зуба. Трудности с его созданием вызваны тем, что составляющие зуба развиваются из различных источников: часть из производных нервной системы — нервного гребня, а часть из эпителиальной выстилки ротовой полости. Совместить эти источники in vitro длительное время не удавалось. На сегодняшний момент в искусственных условиях частично воспроизведены лишь ранние стадии развития зуба. Как правило, без помощи организма здесь не обойтись и после этапа лабораторной работы прообраз будущего зуба все равно приходится подсаживать в его естественное окружение — альвеолу челюсти (зубную лунку) — для полного «созревания» тканеинженерной конструкции.

В итоге можно сказать, что минувшее двадцатилетие ознаменовалось становлением новой отрасли биологии и медицины — тканевой инженерии. Специалисты, работающие в этой области, обладают поистине уникальными качествами. Они должны быть в равной степени и врачами, и биологами, а также иметь навыки хирурга. Таковых сейчас нигде не готовят, по крайней мере, в нашей стране. Как правило, тканевые инженеры — это энтузиасты, которые поставили перед собой цель претворить сказку из детства в реальность. Пока общечеловеческая проблема, которой они занимаются, далека от разрешения. Ежегодно сотни тысяч людей по всему миру погибают от хронических заболеваний, так и не дождавшись спасительной пересадки донорского органа. Сегодня, видимо, уже не найдется ученых, которые стали бы отрицать, что тканевая инженерия — это медицина будущего, успехи которой имеют колоссальное значение для всего человечества. Но вместе с тем сложно найти и такого специалиста, который безоговорочно призовет всех лечиться, прибегая к методам тканевой инженерии — слишком уж много вопросов и нерешенных проблем стоит перед этой очень перспективной областью знаний.

Сайты по теме
www.celltranspl.ru — Сайт «Клеточные технологии в медицине». Здесь же размещается электронный журнал «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия».

www.gemabank.ru — Сайт банка стволовых клеток «Гемабанк» посвящен теме хранения и использования пуповинной крови.

organprint.missouri.edu — Сайт научной группы из Университета штата Миссури, США, посвященный напечатанным на специализированном принтере искусственным органам.

) — создание новых тканей и органов для терапевтической реконструкции поврежденного органа посредством доставки в нужную область опорных структур, молекулярных и механических сигналов для регенерации.

Описание

Обычные имплантаты из инертных материалов могут устранить только физические и механические недостатки поврежденных тканей. Целью тканевой инженерии является восстановление биологических (метаболических) функций, т. е. регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом.

Создание тканеинженерного имплантата (графта) включает несколько этапов:

  1. отбор и культивирование собственного или донорского клеточного материала;
  2. разработка специального носителя для клеток (матрицы) на основе биосовместимых материалов;
  3. нанесение культуры клеток на матрицу и размножение клеток в биореакторе со специальными условиями культивирования;
  4. непосредственное внедрение графта в область пораженного органа или предварительное размещение в области, хорошо снабжаемой кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри графта (префабрикация).

Клеточный материал может быть представлен клетками регенерируемой ткани или стволовыми клетками. Для создания матриц графтов применяют биологически инертные синтетические материалы, материалы на основе природных полимеров (хитозан, альгинат, коллаген), а также биокомпозитные материалы. Например, эквиваленты костной ткани получают путем направленного дифференцирования стволовых клеток костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани. Затем полученные остеобласты (молодые клетки кости, отвечающие за ее рост) наносят на различные материалы, поддерживающие их деление, - донорскую кость, коллагеновые матрицы, пористый гидроксиапатит и др. Живые эквиваленты кожи, содержащие донорские или собственные кожные клетки, в настоящее время широко применяются в США, России, Италии. Эти конструкции позволяют улучшить заживление обширных ожоговых . Разработка графтов ведется также в кардиологии (искусственные клапаны сердца, реконструкция крупных сосудов и капиллярных сетей); для восстановления органов дыхания (гортань, трахея и бронхи), тонкого кишечника, печени, органов мочевыделительной системы, желез внутренней секреции и нейронов. металлов в тканевой инженерии используются для контроля роста клеток через воздействие на них магнитными полями разной направленности. Например, таким способом удалось создать не только аналоги структур печени, но и такие сложные структуры, как элементы сетчатки глаза. Также материалы, созданные с помощью метода (electron beam lithography, EBL), обеспечивают наноразмерную поверхности матриц для эффективного формирования костных имплантантов. Создание искусственных тканей и органов позволит отказаться от трансплантации большей части донорских органов, улучшит качество жизни и выживаемость пациентов.

Авторы

  • Народицкий Борис Савельевич
  • Нестеренко Людмила Николаевна

Источники

  1. Нанотехнологии в тканевой инженерии // Нанометр. -www.nanometer.ru/2007/10/16/tkanevaa_inzheneria_4860.html
  2. Стволовая клетка // Википедия, свободная энциклопедия.www.ru.wikipedia.org/wiki/Стволовые_клетки (дата обращения: 12.10.2009).

В последнее время во всем мире наблюдается тревожная закономерность, которая заключающееся в росте количества заболеваний и инвалидизации людей трудоспособного возраста, что настоятельно требует освоения и внедрения в клиническую практику новых, более эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных.

Одним из таких методов наряду с имплантацией и трансплантацией является тканевая инженерия. Клеточная и тканевая инженерия - является последним достижением в области молекулярной и клеточной биологии. Этот подход открыл широкие перспективы для создания эффективных биомедицинских технологий, с помощью которых становится возможным восстановление поврежденных тканей и органов и лечение ряда тяжелых метаболических заболеваний человека.

Цель тканевой инженерии - конструирование и выращивание вне организма человека живых, функциональных тканей или органов для последующей трансплантации пациенту с целью замены или стимуляции регенерации поврежденных органа или ткани. Иными словами, на месте дефекта должна быть восстановлена трехмерная структура ткани.

Обычные имплантаты из инертных материалов могут устранить только физические и механические недостатки поврежденных тканей, - в отличие от тканей, полученных методом инженерии, которые восстанавливают, в том числе, и биологические (метаболические) функции. То есть, происходит регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом.

Однако для развития и совершенствования методов реконструктивной медицины на базе тканевой инженерии необходимо освоение новых высокофункциональных материалов. Эти материалы, применяемые для создания биоимплантатов, должны придавать тканеинженерным конструкциям характеристики, присущие живым тканям. Среди этих характеристик:

  • 1) способность к самовосстановлению;
  • 2) способность поддерживать кровоснабжение;
  • 3) способность изменять строение и свойства в ответ на факторы окружающей среды, включая механическую нагрузку.

Наиболее важным элементом успеха является наличие необходимого количества функционально активных клеток, способных дифференцироваться, поддерживать соответствующий фенотип и выполнять конкретные биологические функции. Источником клеток могут быть ткани организма и внутренние органы. Возможно использование соответствующих клеток от пациента, нуждающегося в реконструктивной терапии, или от близкого родственника (аутогенных клеток). Могут быть использованы клетки различного происхождения, в том числе первичные и стволовые клетки. Первичные клетки - это зрелые клетки определенной ткани, которые могут быть взяты непосредственно от организма-донора (ex vivo) хирургическим путем. Если первичные клетки взяты у определенного организма-донора, и впоследствии необходимо имплантировать эти клетки ему же в качестве реципиента, то вероятность отторжения имплантированной ткани исключается, поскольку присутствует максимально возможная иммунологическая совместимость первичных клеток и реципиента. Однако первичные клетки, как правило, не способны делиться - их потенциал к размножению и росту низок. При культивировании таких клеток in vitro (посредством тканевой инженерии) для некоторых типов клеток возможна дедифференцировка, то есть потеря специфических, индивидуальных свойств. Так, например, хондроциты, вводимые в культуру вне организма, часто продуцируют фиброзный, а не прозрачный хрящ.

Поскольку первичные клетки не способны делиться и могут потерять свои специфичные свойства, возникла необходимость альтернативных источников клеток для развития технологий клеточной инженерии. Таковой альтернативой стали стволовые клетки.

Стволовые клетки - недифференцированные клетки, которые имеют способность к делению, самообновлению и дифференцировке в различные типы специализированных клеток под воздействием конкретных биологических стимулов.

Стволовые клетки подразделяются на "взрослые" и "эмбриональные". Эмбриональные стволовые клетки образуются из внутренней клеточной массы развития зародыша на ранней стадии, а взрослые - из тканей взрослого организма, пуповины или даже плодных тканей. Однако существует этическая проблема, связанная с неизбежным разрушением человеческого эмбриона при получении эмбриональных стволовых клеток. Поэтому предпочтительнее "добыча" клеток из тканей взрослого организма. Так, например, в 2007 году Шинью Яманакой (Shinya Yamanaka) из Киотского университета Японии были открыты индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), получаемые из покровных тканей человека (в основном, из кожи). ИПСК открывают поистине невиданные возможности для регенеративной медицины, хотя, прежде чем они всерьез войдут в медицинскую практику, предстоит решить еще немало проблем.

Для направления организации, поддержания роста и дифференцировки клеток в процессе реконструкции поврежденной ткани необходим специальный носитель клеток - матрикс, представляющий из себя трехмерную сеть, похожую на губку или пемзу. Для их создания применяют биологически инертные синтетические материалы, материалы на основе природных полимеров (хитозан, альгинат, коллаген) и биокомпозиты. Так, например, эквиваленты костной ткани получают путем направленной дифференцировки стволовых клеток костного мозга, пуповинной крови или жировой ткани в остеобласты, которые затем наносят на различные материалы, поддерживающие их деление (например, донорскую кость, коллагеновые матрицы и др.).

На сегодняшний день одна из стратегий тканевой инженерии такова:

  • 1) отбор и культивирование собственных или донорских стволовых клеток;
  • 2) разработка специального носителя для клеток (матрицы) на основе биосовместимых материалов;
  • 3) нанесение культуры клеток на матрицу и размножение клеток в биореакторе со специальными условиями культивирования;
  • 4) непосредственное внедрение тканеинженерной конструкции в область пораженного органа или предварительное размещение в области, хорошо снабжаемой кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри конструкции (префабрикация).

Матриксы через некоторое время после имплантации в организм хозяина полностью исчезают (в зависимости от скорости роста ткани), а в месте дефекта останется только новая ткань. Также возможно внедрение матрикса с уже частично сформированной новой тканью ("биокомпозит"). Безусловно, после имплантации тканеинженерная конструкция должна сохранить свои структуру и функции в течение периода времени, достаточного для восстановления нормально функционирующей ткани в месте дефекта, и интегрироваться с окружающими тканями. Но, к сожалению, идеальные матриксы, удовлетворяющие всем необходимым условиям, пока не созданы.

Перспективные тканеинженерные технологии открыли возможность лабораторного создания живых тканей и органов, но перед созданием сложных органов наука пока бессильна. Однако сравнительно недавно ученые под руководством доктора Гунтера Товара (Gunter Tovar) из Общества Фраунгофера в Германии сделали огромнейший прорыв в сфере тканевой инженерии - они разработали технологию создания кровеносных сосудов. А ведь казалось, что капиллярные структуры создать искусственно невозможно, поскольку они должны быть гибкими, эластичными, малой формы и при этом взаимодействовать с естественными тканями. Как ни странно, но на помощь пришли производственные технологии - метод быстрого прототипирования (другими словами, 3D-печать). Подразумевается, что сложная трехмерная модель (в нашем случае кровеносный сосуд) печатается на трехмерном струйном принтере с использованием специальных "чернил".

Принтер наносит материал послойно, и в определенных местах слои соединяются химически. Однако заметим, что для мельчайших капилляров трехмерные принтеры пока недостаточно точны. В связи с этим был применен метод многофотонной полимеризации, используемый в полимерной промышленности. Короткие интенсивные лазерные импульсы, обрабатывающие материал, так сильно возбуждают молекулы, что они взаимодействуют друг с другом, соединяясь в длинные цепочки. Таким образом, материал полимеризуется и становится твердым, но эластичным, как естественные материалы. Эти реакции настолько управляемы, что с их помощью можно создавать мельчайшие структуры по трехмерному "чертежу".

А для того, чтобы созданные кровеносные сосуды могли состыковаться с клетками организма, при изготовлении сосудов в них интегрируют модифицированные биологические структуры (например, гепарин) и "якорные" белки. На следующем этапе в системе созданных "трубочек" закрепляются клетки эндотелия (однослойный пласт плоских клеток, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов) - для того, чтобы компоненты крови не приклеивались к стенкам сосудистой системы, а свободно транспортировались по ней.

Однако прежде чем действительно можно будет имплантировать выращенные в лаборатории органы с собственными кровеносными сосудами, пройдет еще какое-то время.

Осенью 2008 года руководитель клиники Университета Барселоны (Испания) и Медицинской школы Ганновера (Германия) профессор Паоло Маккиарини (Paolo Macchiarini) провел первую успешную операцию по трансплантации биоинженерного эквивалента трахеи пациентке со стенозом главного левого бронха на протяжении 3 см.

В качестве матрикса будущего трансплантата был взят сегмент трупной трахеи длиной 7 см. Чтобы получить природную матрицу, по свойствам превосходящую все то, что можно сделать из полимерных трубок, трахею очистили от окружающей соединительной ткани, клеток донора и антигенов гистосовместимости. Очищение заключалось в 25 циклах девитализации с применением 4% -деоксихолата натрия и дезоксирибонуклеазы I (процесс занял 6 недель). После каждого цикла девитализации проводили гистологическое исследование ткани для выявления количества оставшихся ядросодержащих клеток, а также иммуногистохимическое исследование на наличие в ткани антигенов гистосовместимости HLA-ABC, HLA-DR, HLA-DP и HLA-DQ. Благодаря биореактору собственной разработки ученые на поверхность медленно вращающегося отрезка трахеи равномерно нанесли шприцем суспензию клеток. Затем трансплантат, наполовину погруженный в среду для культивирования, вращался вокруг своей оси с целью попеременного контакта клеток со средой и воздухом.

После того, как была определена пригодность разлагаемого полимера для применения в костной тканевой хирургии, он должен был быть сформирован в пористый каркасный материал. Здесь необходимы два главных этапа. Во-первых, нужно разработать способ превращения полимера в объемный материал. Во-вторых, требуется способ сделать этот материал пористым.

Изготовление материала для тканевой инженерии

Правильный способ изготовления материала, или структурирования, частично зависит от химической природы полимера. Длинные, линейные, сатурированные полимеры, такие как PLGA, обыкновенно формируются в объемный материал переплетением отдельных полимерных цепей, чтобы образовать свободносвязанную полимерную сетку. Переплетение полимерной цепи часто достигается с помощью отливки полимера в форме. Таким образом, полимер расплавляется в растворителе, потом раствор заливается в форму или оболочку, впоследствии растворитель испаряется, оставляя полимер в виде объемного материала в форме оболочки. В качестве альтернативы, вливание полимера может осуществляться с помощью нагревания, давления или и того, и другого. Так, полимер помещается в форму, нагревается до своей температуры стеклования и с применением давления принимает форму оболочки. Преимущество этих способов в том, что они относительно просты. Однако, так как материал является упругим телом только из-за переплетенных полимерных цепей, в целом материалу недостает механической прочности. Этот недостаток трудно преодолеть без изменения химического строения полимера.

Еще один способ сформировать объемный материал из линейного полимера включает образование химических связей между полимерными цепями, известное как полимерное связывание. Связывание наиболее часто производится между ненасыщенными углерод-углеродными двойными связями, следовательно, эта составляющая, или другая, дающая аналогичную реакцию, должна существовать где-нибудь в полимерной цепи. Система инициации, обычно радикальная или ионная, также необходима для обеспечения связывания. Система инициации соединяется с полимером и, в ответ на импульс, такой как тепло, свет, химический ускоритель или просто время, инициатор образует продукт, распространяющий связывание. Так как эти полимеры сформированы в объемный материал с помощью ковалентного связывания, они обычно обладают значительной механической прочностью. Более того, их способность к затвердеванию в ответ на приложенный импульс позволяет вводить эти материалы в поврежденный участок, чтобы они затвердевали на месте. Важнейший недостаток связываемых материалов в том, что растущая сложность материала в условиях множества компонентов и наличия химической реакции часто ведет к проблемам с цитотоксичностью и биосовместимостью.

Также следует заметить, что отправная точка материала может не являться полимером, а может быть меньшей молекулой, такой как олигомер или мономер. С этими меньшими молекулами материал может формироваться с помощью инициации их полимеризации. Полимеризованные мономеры могут впоследствии сформировать объемный материал посредством переплетения длинных полимерных цепей в случае с бифункциональным мономером, или разветвления сеток в случае с мультифункциональными мономерами. Преимущества и недостатки, связанные с полимеризацией мономера, такие же, как с полимерным связыванием.

Методы, описанные выше, могут применяться как к гидрофобным, так и к гидрофильным полимерам. Основное преимущество гидрофобных полимеров, таких как PLA, над гидрофильными полимерами, такими как PEG, состоит в сравнительной прочности образуемого геля. Однако, гидрофобные полимеры в целом не могут использоваться для клеточной инкапсуляции, так как гель препятствует транспортировке воды, питательных веществ и отходов к клетке и из нее. Гели, образованные из гидрофобных полимеров, обычно используются в качестве каркаса, в котором клетки и ткани присоединяются к поверхности материала более чем внутри материала. Для применения в клеточной инкапсуляции особенно полезными являются гидрофильные полимеры (39, 46-51, 59-61). Эти полимеры образуют гель, который часто содержит до 90 % воды, что допускает значительную пассивную диффузию молекул в клетку и из нее. Высокое содержание воды, к сожалению, часто влечет за собой ухудшение механических свойств геля. В костной тканевой инженерии гидрогели могут использоваться в среде, не несущей нагрузок или в качестве компонента внутри каркаса, обладающего достаточно высокими механическими качествами. Выбор между гидрофильным и гидрофобным полимерами зависит, в основном, от рассматриваемой стратегии тканевой инженерии, а также от самих тканей.

Биомиметические материалы

Последние исследования сосредоточены на биомиметических материалах. Биомиметические материалы, созданные, чтобы более точно воспроизводить структуру внеклеточного матрикса, обычно являются гидрогелями, призванными особым образом взаимодействовать с определенным видом клеток таким образом, чтобы создать искусственную ткань, обладающую необходимыми свойствами. В целом, эти материалы впервые были получены путем создания материала, практически полностью предотвращающего клеточную адгезию. Далее, сигнальные молекулы, чаще всего короткие пептидные последовательности, полученные адгезией белков и участвующие в специфичной клеточной адгезии, ковалентно связываются с материалом. В результате получается материал, допускающий прикрепляться к его поверхности или проникать в его поры только особый вид клеток.

Очень важный фактор, который часто упускается из вида, это то, что первоначальный материал должен предотвращать случайную клеточную адгезию, чтобы окончательный материал обладал специфичной адгезией. Это часто достигается путем использования гидрогеля в качестве основного материала, так как считается, что гидрофильность гидрогелей предотвращает адсорбцию гидрофобных белков, необходимую для клеточной адгезии. Дополнительные факторы, определяющие успех этой стратегии, – объединение пептидной последовательности в наполнителе, более чем на поверхности материала, ограниченное расстояние, предоставленное пептидной последовательности, таким образом, становится возможно привязать ее к рецепторам поверхности клетки, и плотность пептидных последовательностей внутри материала. Наконец, дальнейшие исследования пептидных последовательностей, специфичных для адгезии отдельных клеточных популяций, необходимы для дальнейшего успеха этой методики.

Порообразование

После того, как была разработана методика превращения полимера в твердый материал, необходимо найти способ образования пористой структуры внутри материала. Самая простая методика – включение порогена в материал перед приготовлением, а после извлечь пороген. Объем, однажды заполненный порогеном, потом остается пустым, образуя поры внутри материала. Зная плотность материала и порогена, можно вычислить пористость, контролируя вес порогена относительно материала. Этот метод, известный как выщелачивание порогена, наиболее легко выполним с использованием порогена, растворимого в воде, такого как соль, сахар или крупицы желатина, который может быть извлечен замачиванием конструкции в воде. Принцип этого метода в том, что может быть собрано достаточное количество порогена, таким образом, отдельные поры соприкасаются друг с другом, образуя связанную пористую структуру внутри материала. Связанная пористость необходима не только для своевременного извлечения порогена, но и для создания каркаса для жизнеспособных тканей. Количество порогена, необходимое для соединяемости, зависит от материала и порогена, но обычно 70 % веса конструкции занимает пороген. Наконец, порогенный метод имеет то преимущество, что связанная пористость может быть достигнута простым измерением веса каркасной конструкции до и после извлечения порогена, если вес порогена, содержащегося в каркасной конструкции, равен весу, потерянному порогенным выщелачиванием, связанность достигнута.

Вторая основная методика формирования пористой структуры включает использование газа для образования пор внутри материала. Обычно газы, такие как азот или углекислый газ, вводят в состав объемного материала во время его приготовления, продувая материал газом или образуя газ как продукт химической реакции. Другой способ – образование пузырей замороженного растворителя, которые постепенно извлекаются испарением, чтобы получить пористую структуру материала. Опять же, основной принцип этого метода – объединение достаточного объема газа для формирования связанной пористой структуры.

В настоящее время разработаны более простые технологии создания каркасных структур с определенным строением. К настоящему моменту эти методы чаще всего используются для образования пористых каркасов, таких как описанный выше, для получения каркаса случайного строения. Это случайное пористое строение имеет два недостатка. Во-первых, оно сильно ухудшает механические свойства каркаса. Это ведет к необходимости создания материалов с очень высокими механическими качествами, чтобы полученный каркас мог использоваться в костной тканевой инженерии, а это ограничивает выбор применяемых материалов. Во-вторых, не менее важно то, что случайная пористость мешает серьезным исследованиям влияния каркасной структуры на образование тканей – проблема очень серьезная для костной тканевой инженерии. Ведущие методы создания каркасов с заданным строением включают в себя техники быстрого изготовления моделей, такие как трехмерное отпечатывание и стереолитография.

J.P. Fisher and A.H. Reddi, Functional Tissue Engineering of Bone: Signals and Scaffolds
Перевод Борисовой Марины

- Заруи Ивановна, говорят, что тканевая инженерия воплощает фантастику в жизнь. Над какими фантастическими проектами работает сегодня ваша лаборатория?

Тканевая инженерия - это конструирование и выращивание живых функциональных тканей или органов вне организма для последующей трансплантации пациенту. На месте дефекта должна быть восстановлена трехмерная структура ткани. Целью является регенерация ткани, а не просто замещение ее синтетическим материалом. Основная направленность нашей лаборатории - создание коллекции мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани взрослых людей. Эмбриональные стволовые клетки выделяются из внутренней клеточной массы зародыша на ранней стадии, а взрослые - из разных тканей взрослого организма. Существует этическая проблема, связанная с неизбежным разрушением эмбриона человека при получении эмбриональных стволовых клеток. Поэтому предпочтительнее получение клеток из ткани взрослого организма. Возможно, лет 20 назад это действительно могло восприниматься как фантастика, но сегодня это современная инновационная технология. Именно этим мы и занимаемся. Протоколы, привезенные из США (а я работала десять лет в лаборатории университета им. Джорджа Вашингтона), позволяют нам не разрабатывать методику с нуля, а продолжать работу в этом направлении.

- Какие задачи стоят перед лабораторией в Институте физиологии?

В Институте физиологии уже достаточно давно проводятся исследования на уровне организмов и внеклеточных моделей. Клеточная культура и тканевая инженерия предоставляют возможность развивать эту область, изучать молекулярные механизмы преобразования клеток в ткани, выращенных специально для дальнейшей трансплантации. Мы (а это я и трое моих молодых сотрудников), работаем в лаборатории с жировой (адипозной) тканью, из которой относительно легко выделяются стволовые клетки. Из них можно вырастить клетки сердечной ткани - кардиомиоциты с заданной структурой, функционально активные, способные к сокращению, а также нервные и кожные клетки в зависимости от цели исследования. Наша лаборатория пока владеет не всеми этими методиками, но они опубликованы, так что это дело времени.

В тканевой инженерии есть два основных компонента. Это клетки и среда, в которой они должны расти. Предположим, мы уже умеем делать из стволовой клетки мышечную клетку и клетку сердечной мышцы, которая отличается от обычной мышцы, а также клетки кожи, печени. Но и этого недостаточно, им необходима среда обитания. И не просто жидкая среда, а трехмерное пространство, в котором могут расти клетки для создания искусственной ткани. Необходим и специальный носитель клеток, так называемый матрикс. Для создания матриксов применяют биологические инертные материалы, одним из которых является коллаген. В последние пять-шесть лет широкое развитие получило создание естественных или, как их еще называют, обесклеточных матриксов. Объясню, что это такое. Каждая наша ткань, каждый наш орган имеют свою архитектуру. Исследования, проведенные в крупных научных центрах США и Японии, показали, что можно взять орган и отмыть его от всех клеток, сохранив при этом его архитектуру. Главное - обеспечить условия, при которых приготовленный заранее раствор, основным компонентом которого является детергент (мыло), протекал через все питающие этот орган сосуды, растворяя мембраны клеток и оставив лишь белковый остов. Чтобы удостовериться, что мы тоже можем это сделать, мы взяли сердце крысы, обработали его раствором детергента и по окончании эксперимента остался только каркас - мраморное сердечко. Вся архитектура органа, а она построена из белка, сохранилась. Мыло, как известно, на белок не действует. Клеточки, которые потом прокапываются изнутри, застревают в этом уже сложенном сердце, создают свои обратные связи и сердце начинает работать.

Конечно, сейчас пришли новые технологии, развивается биопечать, так называемая 3Д печать, которая позволяет напечатать матрикс или сердце. Но для этого надо дать принтеру специальные дорогостоящие "чернила". Сделать его из бумаги тоже не получится, матрикс не будет держаться. Чтобы он держался, необходимо выделить или синтезировать специализированные белки, в основном коллагены, которые создают архитектуру любого органа. В наших условиях это очень дорогая задача, легче получить обесклеточный орган. Но, предположим, мы все это собрали и ретрансплантировали, например, поставили заплатку на коже, но тут можем столкнуться с классической проблемой трансплантации - отторжением. Поэтому мы являемся лабораторией не просто тканевой инженерии, но и иммунологии.

Теоретически все клетки любого организма похожи и отличаются лишь поверхностными молекулами, которые кодируются молекулами, известными данной иммунной системе. Если смыть эти молекулы вместе с несущими их клетками, то теоретически матрикс не должен вызывать иммунную реакцию организма. Но никто этих исследований пока не делал.

Следующий этап - определить самые легкодоступные, дешевые, но работающие матрицы. Это второе направление нашей исследовательской деятельности. Оба направления мы пытаемся свести в одно, чтобы исследовать фундаментальные аспекты регенерации ткани. Иногда фундаментальную науку считают оторванной от действительности, но результаты исследования нашей лаборатории имеют конкретное приложение. Фрагменты ткани, выращенные в основном из кожи, наиболее легко приживаются при трансплантации. В США, Японии, Европе они широко используются при ожогах, пластических операциях и т.д., что со временем будет делаться и у нас. Но это будет уже вне академической организации.

- Наука Армении финансируется по остаточному принципу. Создать новую лабораторию иммунологии и тканевой инженерии требует немалых вложений. Как это удалось?

Приходится, конечно, выкручиваться. Идея создания лаборатории возникла благодаря инициативе Института физиологии и коллаборации с университетом им. Джорджа Вашингтона в США, где я остаюсь членом кафедры. Американские коллабораторы помогают всем, чем могут, делятся и оборудованием, реагентами. Заведующая лабораторией кардиофизиологии этого университета, ученый с мировым именем и наша соотечественница - профессор Нарине Сарвазян, заинтересованная, чтобы у нас тут все состоялось, помогает не только финансово, но и интеллектуально. Мы обговариваем идеи, изыскиваем варианты, чтобы получить результаты при очень скромных финансовых возможностях. Иногда она даже повторяет наш эксперимент в своей лаборатории, чтобы уточнить результат. Для выращивания клеток мы используем инкубатор старого советского образца. Институт выделил нам два компьютера, отремонтировал комнаты, выделенные лаборатории, предоставил пару старых стерильных боксов, хотя и не того уровня, что требуется, поэтому мы часто пользуемся аппаратурой лаборатории Наиры Айвазян, с которой активно сотрудничаем. Холодильник приобрели сами. В вопросе оснащения у нас пока еще много проблем, особенно необходим новый инструментарий. Из-за отсутствия прибора проточный цитометр не получается продуктивно сотрудничать с нашим коллаборатором - косметическим центром "Авангард" в Аване. Но мы расширяем контакты и исследовательские возможности.


Мои друзья, московские биологи, уверяли, что клетки - дамы капризные, и с ними необходимо разговаривать, иначе они обидятся и перестанут расти. Клетки обычно выделяются из женских особей, их надо любить. Придя утром в лабораторию, надо подойти к инкубатору и пожелать клеткам доброго утра, сказать что-то приятное, поговорить. Вы смеетесь, но это так. В университете им. Джорджа Вашингтона у меня был коллега, который игнорировал это правило, и клетки у него не росли. Ему пришлось обязать своих аспирантов каждое утро подходить к инкубатору и делать клеткам комплименты. Кроме того, клетке нужна наша защита. Взяв клетку из организма, мы лишаем ее иммунитета, теперь она рассчитывает только на нас и стерильную технику. Стерильность, которую мы должны обеспечивать, хирургам даже не снилась.

- С кем еще сотрудничает лаборатория?

Внутри института мы сотрудничаем с лабораториями Наиры Айвазян и Армена Восканяна. Они проводят свои исследования на биохимическом уровне или синтетических субстратах - отделяют жир, создают из него искусственное подобие клетки, формируют везикулы и на них исследуют влияние различных токсинов. Лучше это делать на растущих клетках. Поэтому еще одно направление деятельности лаборатории - изучение влияния наших эндемических ядов на активно растущие клетки. Не важно раковые это, эмбриональные или сердечные клетки. Не зная молекулярную физиологию действия ядов, не зная молекулярного механизма, создать конкретное противоядие сложно. Только поняв, какая молекула влияет на этот механизм, можно применять противоядие. Поэтому и отвечать на вопрос, почему взяли именно эту молекулу, надо на молекулярном уровне.

- Биотехнологии - наука очень дорогая, но обычно ученых выручают гранты...

Мы получили грант Госкомитета по науке, он рассчитан на два года. Но сумма не очень значительна. Надеялись получить и грант МНТЦ. Наладили коллаборацию с коллегами из Казахстана, где сейчас базируется МНТЦ, создали связь, но не получилось. Почему, не знаю. Отсутствует обратная связь. А мы на эти деньги рассчитывали.